T 4 DNA Ligase

Beschreibung:
T4 DNA Ligase katalysiert die Formation der Phosphodiesterbindungen zwischen den 5′-Phosphat- und 3′-Hydroxylenden in der duplex DNA/RNA. Das Enzym verbindet die ‹blunt›-Enden und die kohäsiven Enden, repariert Einzelstrangbrüche in der duplex DNA, RNA, oder DNA/RNA-Hybriden. Diese T4 DNA Ligase wurde aus einem E. coli Klon gewonnen, der ein Plasmid enthält, das die Synthese der T4 DNA Ligase steuert.

Konzentration: 2,5 WU/µl

Anwendung:
Klonierung von Restriktionsverdau-Fragmenten, verbinden der Linker und Adapter zu ‹blunt-ended› DNA, Gen- (Genfragment) Synthese.

Kohäsive Enden-Ligation:
Für die meisten kohäsiven Endligationen ist eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei 20°C ausreichend. Inkubationen bei 16°C für 4 – 16 Stunden werden routinemäßig für die Mehrheit der Anwendungen durchgeführt.

Ligationen von ‹blunt end› und Einzelbasenpaar-Überhangfragmenten benötigten mehr Enzym, um dasselbe Maß an Ligation zu erhalten, wie bei kohäsiven End-DNA-Fragmenten. Die Ligation kann möglicherweise durch die Zugabe von PEG oder durch die Reduzierung der rATP-Konzentration gesteigert werden. ATP ist ein essentieller Kofaktor für die Reaktion.

Lagerpuffer:  50 mM KCl, 10 mM Tris · HCl (pH 7,4), 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 % Glycerin.

Reaktionspuffer (10x) enthält 500 mM Tris · HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT und 10 mM ATP

Einheitendefinition:
Eine Einheit ist definiert als die Menge Enzym, die benötigt wird, um eine 50%ige Ligation eines Hind III-Fragmentes einer Lambda DNA in 30 Minuten bei 16°C bei einer Konzentration von 5′-Enden von 0,12 μM (300 μg/ml) zu erhalten. Eine kohäsive End-Ligationseinheit entspricht 0,015 Weiss Einheiten. Eine Weiss-Einheit entspricht 67 kohäsiven End-Ligationseinheiten. Jede Charge einer T4 DNA Ligase wird auf die Abwesenheit von Endonukleasen/Exonukleasen und in einem blau/weiß Klonierungsansatz getestet.

Haltbarkeit: ca. 24 Monate bei -20°C

Lagerung: bei – 20°C

Transport: mit Kühlakkus